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熒光原位雜交儀有哪些操作注意事項?

2022-05-11 17:27:45

熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技術問世于20世紀70年代后期,其基本原理是利用標記了熒光素的核酸作為探針,按照堿基互補原則,與待檢樣本中與之互補的核酸經過變性-退火而形成雜交雙鏈核酸,通過熒光顯微鏡進行檢測和分析。是一種在細胞遺傳學水平上檢測染色體及基因數目以及結構異常的一種分子生物學技術。該技術具有快速、安全、靈敏度高、探針可長期保存的特點,已廣泛地應用于細胞遺傳學、腫瘤學生物學、基因定位、基因作圖、基因擴增、產前診斷等不同領域。

熒光原位雜交儀廠家

1 、開展FISH所需要的實驗條件和人員培訓

建立FISH技術平臺,除需要一間可以進行熒光實驗操作和顯微觀察暗室外,還需要原位雜交儀、熒光顯微鏡、顯微鏡濾光 片 、水浴箱 、漩渦混合器 、普通離心機 、移液器 、FISH探針試劑盒、無水乙醇、二甲苯、去離子水、橡膠水泥、透明指 甲油等設備和試劑。


由于FISH檢測具有敏感性和客觀性,任何一個步驟的微小失誤均有可能對結果的判讀產生偏差,進而對臨床的合理用藥產生影響,因此就對操作的技術人員在熟練和規范程度做出更高的要求。作者建議每一個開展分子病理檢測的 病理科設置專門的分子病理室并由專人操作,并且要求專門的技術人員有相關的分子生物學理論知識,并經過專門培訓,有一定的實驗室工作經驗。


2 、固定液的選擇及固定時間

石蠟組織建議用 10%中性緩沖福爾馬林固定 6~48h, 其它固定液對實驗結果可能產生一定的影響。組織離體后 應盡快固定,建議在標本離體后 30min內固定。如樣本固定不及時,熒光信號會減弱。固定液的體積是組織體積的 4~20倍,否則固定不充分,容易出現無信號或者信號很弱的現象。而且,為了確保信號的準確性,蠟塊盡量在2年內進行檢測,已經切好的切片在 6周內檢測為佳。


3 、組織切片和載玻片的選擇

組織切片 4~5μm厚,過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產生影響,而且切片應完整,質量良好,否則會在預處理 時掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片,有條件的實驗 室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片,可有效防止脫片現象的發生。


4 、實驗過程中切片的預處理

切片預處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當組織 處理不規范、切片過厚或烤片不足時,在煮沸過程中容易掉 片,建議烤片溫度在 56°C過夜。煮沸過程中要嚴格控制實 驗溫度和時間。酶消化是 FISH實驗的關鍵步驟之一,如果 對組織不熟悉,可以先消化推薦的反應時間,然后復染DAPI在熒光顯微鏡下觀察,在 DAPI通道下,以細胞既無空洞(消化過度),亦 無明顯 的云霧狀 (消化不足 )為佳 ,同時可切換觀察紅綠通道,以紅綠通道無明顯的背景為佳,如果背景較高,可適當延長消化時間。另外,對于陳舊的石蠟組織切片,要適當延長消化時間,否則會出現大量的自發熒光。若 消化不足所致 FISH信號減弱或丟失,消化良好時FISH信號較好。


5、 變性和雜交

變性和雜交是本實驗關鍵的步驟,變性的時間和溫度是雜交成功是否的關鍵,為確保變性期間溫度的穩定,建議采用專業的原位雜交儀進行變性和雜交步驟,不僅能夠減少實驗的繁瑣性,而且更有利于實驗條件的控制,比如時間、溫度和避光條件等。為避免雜交液在變性和雜交過程 中的損失和防止干片,一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進行密封。


6、 雜交后洗滌溫度、時間和封片保存

雜交后的洗滌對于整個實驗結果的影響非常重要,首先應確保正確配置雜交洗滌液 ,洗滌液溫度偏高或時間過長 ,可導致信號減弱,洗滌液溫度偏低或者時間過短,會產生雜信號過多、紅綠信號對比性差或者特異性低等情況。


在復染完 DAPI以后,加蓋蓋玻片,用指甲油固定住蓋玻片四角,這樣可以防止在油鏡下觀察時蓋玻片脫落。由于 熒光信號容易淬滅,所以在染色后應立即觀察,如果當時不 能觀察,可將切片放入切片盒中,保存于 -20°C冰箱里2周以內。


7、 設置對照

每次實驗需設置標準對照:實驗室在每一輪檢測中均應使用標準化對照材料(陽性、陰性和可疑)。如果對照材料 沒有顯示預期的結果,則不能對結果做出判定。


8、 結果判讀

應選擇細胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一 、 細胞核無重疊、信號清晰的細胞。隨機計數至少20個浸潤性癌細胞核中的雙色信號。判讀標準參考專業書籍,對于FISH結果不確定的病例,需要再計算 20個細胞核中的信號或由另外一位病理診斷醫師重 新計數。如仍為臨界值,則應行免疫組化檢測(若FISH檢測前未行),也可以選取不同的組織塊重新檢測。

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